一、背景

機(jī)械負(fù)荷是工程心血管組織中組織特性的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑。為了最終調(diào)節(jié)生化過程，必須量化機(jī)械負(fù)荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機(jī)硅層中，以允許心血管工程結(jié)構(gòu)的長期單軸循環(huán)機(jī)械應(yīng)變。與未應(yīng)變構(gòu)建體相比，這些構(gòu)建體承受了兩種不同的應(yīng)變量級(jí)，并且在生化性能、力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面表現(xiàn)出差異。結(jié)果表明，當(dāng)組織暴露于長時(shí)間的機(jī)械刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)比例的膠原蛋白的產(chǎn)生。然而，以大應(yīng)變大小的應(yīng)變對組織的機(jī)械性能產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，動(dòng)態(tài)應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列。所提出的模型系統(tǒng)可用于系統(tǒng)地優(yōu)化工程心血管組織的培養(yǎng)方案。

機(jī)械調(diào)節(jié)對細(xì)胞生物合成活性的影響已經(jīng)在二維和三維培養(yǎng)條件下進(jìn)行了研究，并且這種效果取決于ECM的性質(zhì)。 通過使用各種培養(yǎng)系統(tǒng)（例如縱向拉伸裝置和真空驅(qū)動(dòng)裝置）刺激細(xì)胞。 已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，著眼于機(jī)械刺激對復(fù)雜幾何形狀的組織重塑的影響。在定義明確的簡單幾何中進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。 塞利克塔等培養(yǎng)的。成纖維細(xì)胞填充的膠原凝膠（管狀構(gòu)建體）在存在下精確控制變形。只有有限數(shù)量的研究集中在明確定義的機(jī)械負(fù)荷對工程心血管組織特性的影響，其中研究了ECM的從頭形成（例如，用細(xì)胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）。需要對工程結(jié)構(gòu)中的組織特性進(jìn)行機(jī)械控制。這需要詳細(xì)研究明確定義的加載條件對ECM合成和ECM組織的影響，以優(yōu)化加載方案。

二、材料和方法

細(xì)胞和組織培養(yǎng)

人隱靜脈細(xì)胞（HSVC，肌成纖維細(xì)胞）取自一名44歲的女性，并使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法生長。44細(xì)胞在由先進(jìn)的Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素。

將支架真空干燥48小時(shí)，然后暴露于紫外線下1小時(shí)，隨后置于70%乙醇中4-5小時(shí)以獲得無菌。讓支架干燥過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水。在細(xì)胞接種之前，將組織培養(yǎng)基加入支架中16小時(shí)以促進(jìn)細(xì)胞附著。使用纖維蛋白凝膠作為細(xì)胞載體，將第7代的HSVC細(xì)胞接種在這些支架上。細(xì)胞以每厘米約20萬個(gè)細(xì)胞的濃度接種隨后將組織構(gòu)建體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)（在37°C和5%CO2).組織培養(yǎng)基每3-4天更換一次，由補(bǔ)充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸。

應(yīng)變拉伸

將工程心血管構(gòu)建體培養(yǎng)3周，包括6天無施加負(fù)荷以使細(xì)胞在接種后適應(yīng)，然后以2 Hz的頻率進(jìn)行1周的動(dòng)態(tài)應(yīng)變。應(yīng)用三種不同的應(yīng)變條件：0%應(yīng)變，4%動(dòng)態(tài)應(yīng)變和8%動(dòng)態(tài)應(yīng)變（n = 8）。在以4%和8%應(yīng)變的單獨(dú)樣品上進(jìn)行所施加應(yīng)變的測量2周和3周（n = 6）。

機(jī)械測試

培養(yǎng)3周后犧牲構(gòu)建體，并在1小時(shí)內(nèi)測試其機(jī)械性能（n = 6）。從樣品中除去有機(jī)硅層，并將剩余的組織置于組織培養(yǎng)基中以滋潤樣品。樣品的厚度和寬度使用以下命令測定 Plμ 2300 非接觸式光學(xué)圖像輪廓儀。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進(jìn)行掃描。通過對代表性區(qū)域求平均值來獲得厚度和寬度。

組織形成的生化測定

三、結(jié)果

循環(huán)應(yīng)變對組織性質(zhì)的影響

表征不同應(yīng)變大小對工程心血管組織特性、構(gòu)建體的切線剛度以及 DNA、GAG、膠原蛋白和 HP 交聯(lián)量的影響（表1）被量化。相對于未應(yīng)變的工程組織構(gòu)建體，循環(huán)菌株不會(huì)增加工程組織構(gòu)建體中每干重的DNA量。然而，與未過濾的組織結(jié)構(gòu)相比，機(jī)械應(yīng)變結(jié)構(gòu)體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低。另一方面，在兩種應(yīng)變條件下，每個(gè)三螺旋的HP交聯(lián)數(shù)量顯著增加。4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的切線剛度等于未應(yīng)變組織結(jié)構(gòu)的剛度，而8%應(yīng)變結(jié)構(gòu)相對于未應(yīng)變結(jié)構(gòu)和4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的剛度均顯著降低（圖）。4).

細(xì)胞拉伸

圖4

3周齡工程心血管結(jié)構(gòu)的切線剛度（MPa）作為不同應(yīng)變大小的函數(shù)。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05） 的顯著差異，表示與 4% 加載條件 （p < 0.05） 的顯著差異++

四、討論

機(jī)械負(fù)荷是活組織內(nèi)生化過程的重要調(diào)節(jié)器。為了調(diào)節(jié)這些生化過程，必須量化機(jī)械負(fù)荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。在這項(xiàng)研究中，提出了一個(gè)實(shí)驗(yàn)框架，其中使用應(yīng)變系統(tǒng)的改編版本在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對單個(gè)樣品施加各種應(yīng)變量級(jí)。系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高通量的樣品，并且易于長時(shí)間保持無菌狀態(tài)。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機(jī)硅層中，允許這些結(jié)構(gòu)的重復(fù)和單軸長期機(jī)械應(yīng)變。這些構(gòu)建物附著在Bioflex孔（美國Flexcell Int. Corp.）上，經(jīng)受兩種不同的應(yīng)變量級(jí)數(shù)周，與未應(yīng)變的構(gòu)建物相比，在生化性能、機(jī)械性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面顯示出差異。結(jié)果表明，長時(shí)間的機(jī)械刺激誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)分?jǐn)?shù)的膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善了膠原蛋白的內(nèi)在機(jī)械性能。然而，過大的應(yīng)變導(dǎo)致應(yīng)變對組織的機(jī)械性能產(chǎn)生不利影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列。

為了能夠拉伸三維工程心血管結(jié)構(gòu)，模型系統(tǒng)得到了進(jìn)一步發(fā)展。組織結(jié)構(gòu)的組成部分之一是涂有P4HB的PGA，以前沒有表現(xiàn)出彈性材料行為。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態(tài)硅膠中。這允許對這些工程組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)拉伸。在培養(yǎng)2周（1周菌株）后驗(yàn)證應(yīng)變場，支撐有機(jī)硅層的存在導(dǎo)致工程結(jié)構(gòu)的彈性響應(yīng)，這可以通過在培養(yǎng)2周后保留最初施加的應(yīng)變的事實(shí)來說明。然而，3周后的應(yīng)變分布無法確定為結(jié)構(gòu)與支撐有機(jī)硅層部分分離，這大約對應(yīng)于PGA機(jī)械完整性的損失。 雖然應(yīng)變沒有確定，但動(dòng)態(tài)成分仍然存在。這意味著受控應(yīng)變最終可以在 2.5-3 周的時(shí)間內(nèi)應(yīng)用。對不同應(yīng)變場的分析表明，平均應(yīng)變構(gòu)成了所施加的應(yīng)變，對無組織構(gòu)建的膜進(jìn)行了驗(yàn)證。然而，組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)變分布更加不均勻?？赡?，不均勻的變形可以歸因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性。設(shè)置的限制是組織形成（圖。5A-C）由于有機(jī)硅層存在下營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少而收縮到結(jié)構(gòu)表面。

在本研究中，動(dòng)態(tài)應(yīng)變對增殖沒有影響。動(dòng)態(tài)菌株和未菌株構(gòu)建體之間每干重的DNA量沒有差異。以前，在相對長期的研究中，細(xì)胞增殖不受機(jī)械負(fù)荷的影響。2，28，38 然而，Mol等人。38確實(shí)顯示出自由浮動(dòng)工程心血管結(jié)構(gòu)的增殖水平升高，這些結(jié)構(gòu)不受機(jī)械約束。必須認(rèn)識(shí)到，在這項(xiàng)研究中，未應(yīng)變的結(jié)構(gòu)并非沒有壓力。HSVC屬于肌成纖維細(xì)胞表型25，38，這些肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生連續(xù)的等長張力。24 由于工程結(jié)構(gòu)被支撐硅膠層限制為收縮，因此在結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生了內(nèi)部張力。（?。┏衫w維細(xì)胞收縮產(chǎn)生的內(nèi)部應(yīng)力足以限制細(xì)胞增殖。

體內(nèi)活細(xì)胞存在于動(dòng)態(tài)的生理環(huán)境中，受到廣泛的機(jī)械刺激，包括拉伸、壓縮、剪切應(yīng)力和流體靜壓力等。然而在一般的體外培養(yǎng)和分析條件下，細(xì)胞沒有受到來自生長環(huán)境的力學(xué)刺激。通過國產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀，可以提供與體內(nèi)細(xì)胞相似的生理環(huán)境，幫助研究人員分析各種細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的拉伸負(fù)荷的生化變化，包括肌肉、肺、心臟、血管、皮膚等。

詳情介紹

國產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力加載系統(tǒng)

CELL TANK

國產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)

技術(shù)背景：

當(dāng)前細(xì)胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實(shí)際“動(dòng)態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化、細(xì)胞間相互作用與體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)以及基因蛋白表達(dá)改變等。

細(xì)胞牽張系統(tǒng)將帶來跨領(lǐng)域的創(chuàng)新：

●動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前更可靠的評估

細(xì)胞拉伸儀腔體

●干細(xì)胞分化機(jī)制

●機(jī)械刺激力與癌癥的相關(guān)性

●生醫(yī)材料與細(xì)胞動(dòng)態(tài)特性研究

●體外疾病微環(huán)境的快速建立

CellTank一體式細(xì)胞牽張拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)

CELL TANK為細(xì)胞和組織模型提供機(jī)械拉伸條件的平臺(tái)。

國產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀

CELL TANK為細(xì)胞牽張系統(tǒng)使科學(xué)家能夠輕松而精確地將仿生機(jī)械應(yīng)變應(yīng)用于細(xì)胞和組織。

國產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀

預(yù)埋橫桿式培養(yǎng)腔室

拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm

拉伸腔體

可視化圖形操作界面

細(xì)胞拉伸儀界面

細(xì)胞拉伸儀界面

HOW TO USE

1. 細(xì)胞外基質(zhì)涂層進(jìn)行預(yù)處理，將細(xì)胞接種到腔室中，細(xì)胞粘附在基底上，開始過夜培養(yǎng)過程。

2. 細(xì)胞增殖后，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。

3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)收獲/處理細(xì)胞，分析數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢

· 均勻負(fù)載

培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù)，保證每個(gè)細(xì)胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變，非軸向方向上的次級(jí)載荷極低

· 高再現(xiàn)性

高精度步進(jìn)電機(jī)保證在各種速度和拉伸比組合中實(shí)現(xiàn)一致的運(yùn)動(dòng)程序，機(jī)械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激

· 一體式控制

自帶觸摸控制屏，無需電腦。內(nèi)置ARM芯片，高效穩(wěn)定運(yùn)行的同時(shí)簡單易用

· 多樣的拉伸模式

靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時(shí)間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形

· 高通量培養(yǎng)腔室

有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)，包括細(xì)胞固定和熒光成像等

設(shè)備參數(shù)

外形尺寸 350x330x110 mm主機(jī)重量 3 kg拉伸腔體 4個(gè)，32x32 mm / 8個(gè)，20x20 mm控制模式 三角波、正弦波、方波及其組合最大應(yīng)變率 30%最高拉伸速率 30 mm/s最高循環(huán)頻率 2 Hz基底膜厚度 0.2 mm使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱

橫桿拉伸技術(shù)局部應(yīng)變率更均勻

拉伸腔有限元分析

免費(fèi)試用三個(gè)月

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